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网站 免费 认证,华宇网站建设,网站首页logo怎么修改,电商平台链接怎么填写引言 空间转录组#xff08;Spatial Transcriptomics, ST#xff09;技术在传统转录组与单细胞转录组的基础上#xff0c;引入了空间位置信息#xff0c;使研究者能够在组织结构背景下解析基因表达模式。相较于下游分析中对空间结构、生物学机制的深入挖掘#xff0c;上游…引言空间转录组Spatial Transcriptomics, ST技术在传统转录组与单细胞转录组的基础上引入了空间位置信息使研究者能够在组织结构背景下解析基因表达模式。相较于下游分析中对空间结构、生物学机制的深入挖掘上游分析的核心目标在于将测序原始数据转换为高质量、可用于空间建模和生物学解释的表达矩阵与空间坐标信息。空间转录组的上游分析直接决定了后续空间聚类、空间差异基因、空间通讯等分析的可靠性。因此系统、规范地理解其上游分析流程具有重要意义。空间转录组数据类型概述不同空间转录组技术路线其上游数据形态与处理方式存在一定差异但总体可归纳为以下几类1. 基于捕获芯片的空间转录组如 10x Visium原始数据FASTQ空间信息来源芯片上固定位置的 barcode特点一个 spot 通常包含多个细胞2. 原位杂交/成像型空间转录组如 MERFISH、seqFISH原始数据显微图像空间信息来源细胞或分子级坐标特点空间分辨率高基因数相对受限3. 组织切片测序型如 Slide-seq、Stereo-seq原始数据FASTQ bead 坐标文件特点高分辨率、大规模空间点位本文重点以尤其是 10x Visium为代表系统介绍其上游分析流程需要sratoolkit与Space Ranger安装sratoolkit官网安装01. Downloading SRA Toolkit · ncbi/sra-tools Wiki · GitHubhttps://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit下载的为Ubuntu Linux X64 wget -c https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sdk/3.3.0/sratoolkit.3.3.0-ubuntu64.tar.gz 解压即可 tar -zxvf sratoolkit.3.3.0-ubuntu64.tar.gz 可选择添加到环境变量 export PATH$PATH:$PWD/sratoolkit.3.3.0-ubuntu64/binSpace Ranger官网安装Space Ranger | Official 10x Genomics Supporthttps://www.10xgenomics.com/support/software/space-ranger/latest下载Space Ranger wget -O spaceranger-4.0.1.tar.gz https://cf.10xgenomics.com/releases/spatial-exp/spaceranger-4.0.1.tar.gz?Expires1766082461Key-Pair-IdAPKAI7S6A5RYOXBWRPDASignatureehvI5hDYu5uCFb36xyvl-97DQS6mnL506M58Xf5uVC4q33IHmkqx8qx81Ifm3-xAMhKz453qkl~onEejVL~rVQsW4Dtf32sJkDyTBoQtG8WDzTJuoGQk9uIpszGovFixWWuluoxvH2bYAJZH90yNTVz746Iq3DXuveCD0j2gEUiB20~DTPfPkWoMPACy1B2Vd2l2kUE-aG2NcCLtgvvYA0ktj9~SEf299BaD19tkZlWbIvQPbkJomCIG4csLr~69UmTKjOpr~K-1TNw1gc1cq429uREdJJMMlzd6PWfgaIPZu9wLCUJJVcBCcyuYtiJmFUUa79NTInJXei1RbMWPvQ__ 解压 tar -zxvf spaceranger-4.0.1.tar.gz 添加到环境变量 export PATH$PATH:$PWD/spaceranger-4.0.1-ubuntu64/bin 下载参考基因组 人 wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz 解压 tar -zxvf refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz Mouse wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCm39-2024-A.tar.gz Rat wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mRatBN7-2-2024-A.tar.gz下载数据选择的数据SRR编号为SRR27277620GEO编号为GSM7980872组织类型甲状腺癌临床分型ATC空间转录组的上游分析不仅需要fastq文件还需要一个HE组织染色图像。图像一般都在GEO数据库的补充文件中第四个下载解压即可prefetch --max-size 100G SRR27277620 将下载的sra转为fastq fasterq-dump SRR27277612.sra -O fastq_store -e 20 --include-technical 修改名字 mv SRR27277612_1.fastq SRR27277612_S1_L001_R1_001.fastq mv SRR27277612_2.fastq SRR27277612_S1_L001_R2_001.fastq注意sra转为fastq过程中--include-technical→ 保留空间转录组必需的技术读段转完格式之后必须将fastq名称修改为Space Ranger规定的格式样本名_S编号_Lane编号_Read类型_001.fastq.gz组成部分格式示例含义说明必需性Spaceranger 匹配规则样本名PTC,sample1样本标识符与--sample参数一致必需通过--sample指定前缀S编号S1,S2样本在测序中的编号通常必需自动识别无需指定Lane编号L001,L002测序 lane 编号通常必需自动按 lane 分组配对Read类型R1,R2,I1读段类型必需自动配对 R1↔R2文件编号001,002文件批次编号通常为001自动识别一般只有R1和R2两个fastq文件也有的会有I1文件文件类型标准命名主要功能内容长度在空间转录组中的用途R1 (Read 1)*_R1_*.fastq.gz空间barcode UMI28 bp (Visium v1)识别spot位置和分子计数R2 (Read 2)*_R2_*.fastq.gzcDNA序列50-150 bp基因识别和定量I1 (Index 1)*_I1_*.fastq.gz样本index8-10 bp多样本混合时区分样本上游分析前期处理好之后就开始进行空转上游处理在运行spaceranger count时组织图像与芯片坐标的对齐image alignment是一个关键步骤。Space Ranger 实际上提供了两种对齐策略自动对齐Automatic alignment由 Space Ranger 在 count 过程中自动完成手动对齐Manual alignment借助 Loupe Browser 预先完成人工校准再由 Space Ranger 读取结果自动对齐spaceranger count \ --idATC \ --transcriptome/home/duyo/data_251215/huma_data/refdata-gex-GRCh38-2024-A \ --fastqs/home/duyo/data_251215/SRR27277612data/SRR27277612/fastq_store/ \ --sampleSRR27277612 \ --image./GSM7980872_ATC-1_visium_tissue_hires_image.png \ --unknown-slide visium-1 \ --localcores16 \ --localmem64 \ --create-bam false--id分析任务名称同时作为输出目录名。--transcriptome指定 10x 官方格式的人类参考转录组GRCh38。--fastqsFASTQ 文件所在目录。--sample指定需要分析的样本名用于匹配 FASTQ 文件。--image组织切片图像HE用于空间对齐和 in-tissue 判定。--unknown-slide指定芯片类型为标准 10x Visium无芯片序列号时使用。如果知道芯片编号可以使用 --slideV19J01-123不知道芯片序列需要使用--unknown-slide选择芯片的类型后面必须指定以下之一visium-1→ 第一代 Visium 载玻片标准 6.5mm 捕获区visium-2→ 第二代 Visium 载玻片新版设计visium-2-large→ 第二代大尺寸载玻片visium-hd→ 高分辨率 Visium HD 载玻片--localcores使用多少个 CPU 核心进行计算。--localmem分配多少内存供分析使用。--create-bam false不生成 BAM 文件以节省磁盘空间。当看到这几行时说明运行成功了手动对齐需要下载Loupe Browser进行对齐下载连接与教程连接Loupe Browser | Official 10x Genomics Supporthttps://www.10xgenomics.com/support/software/loupe-browser/latest对齐之后会输出一个json文件使用--loupe-alignment指定该文件例如spaceranger count \ --idATC \ --transcriptome/home/duyo/data_251215/huma_data/refdata-gex-GRCh38-2024-A \ --fastqs/home/duyo/data_251215/SRR27277612data/SRR27277612/fastq_store/ \ --sampleSRR27277612 \ --image./GSM7980872_ATC-1_visium_tissue_hires_image.png \ --unknown-slide visium-1 \ --localcores16 \ --localmem64 \ --create-bam false \ -loupe-alignmentSRR27277612.json输出内容说明不同的芯片格式输出内容不同所以分析时最好有芯片序列号参考官网说明Understanding Space Ranger Outputs | Official 10x Genomics Supporthttps://www.10xgenomics.com/support/software/space-ranger/latest/analysis/outputs/output-overview使用芯片Visium HD 或 Visium HD3文件或目录名称描述barcode_mappings.parquet该文件高效存储空间映射信息本质上作为CSV文件追踪Visium HD数据中条码方块、核、单元和箱之间的关系。详情请参见分段输出页面。binned_outputs默认情况下该目录有三个子目录、、和。每个目录包含 、 、 、 和 。该目录仅提供8微米和16微米的频箱尺寸。仅提供8微米的箱体尺寸。仅提供2微米分辨率。square_002umsquare_008umsquare_016umfiltered_feature_bc_matrixraw_feature_bc_matrixspatialfiltered_feature_bc_matrix.h5raw_feature_bc_matrix.h5analysiscloupe.clouperaw_probe_bc_matrix.h5cloupe_008um.cloupe与 .cloupe 文件的 8 微米 bin 尺寸有对称链接cloupe_cell.cloupe与.cloupe文件的单元格分段的对称链接feature_slice.h5一种专为 Visium HD 设计的新文件类型支持高效获取单个或多个基因的 2 微米分辨率图像切片。详情请见此页面。metrics_summary.csv以CSV格式运行汇总指标molecule_info.h5包含所有含有有效条形码、有效UMI且高度确定分配给基因条码或bin的分子的每分子信息。probe_set.csv输入探针集的副本参考CSV文件。segmented_outputs包含分段输出的文件夹。包含 和 。详情请参见分段输出页面。analysiscell_segmentations.geojsoncloupe.cloupefiltered_feature_cell_matrixfiltered_feature_cell_matrix.h5graphclust_annotated_cell_segmentations.geojsongraphclust_annotated_nucleus_segmentations.geojsonnucleus_segmentations.geojsonraw_feature_cell_matrixraw_feature_cell_matrix.h5spatialspatial包含数据空间性的输出文件夹。更多详情请参见空间输出页面。web_summary.html以HTML格式运行汇总指标和图表使用Visium v1/v2文件或目录名称描述web_summary.html以HTML格式运行汇总指标和图表cloupe.cloupe放大镜浏览器可视化与分析文件spatial/包含数据空间性的输出文件夹。analysis/包含次级分析数据的文件夹包括基于图的聚类和K均值聚类K 2-10;簇间的基因表达差异;PCA、t-SNE和UMAP降维。metrics_summary.csv以CSV格式运行汇总指标probe_set.csv输入探针集的副本参考CSV文件。关于Visium FFPE和CytAssist工作流程的呈现possorted_genome_bam.bam索引BAM文件包含位置排序的读段与基因组和转录组对齐并附有条形码信息possorted_genome_bam.bam.bai索引。如果参考转录组是从染色体非常长的基因组512 Mbp生成的Space Ranger v2.0 会生成索引文件。possorted_genome_bam.bampossorted_genome_bam.bam.csifiltered_feature_bc_matrix/仅包含MEX格式的组织相关条码。矩阵中的每个元素分别是与特征行和条码列相关的UMI数量。该文件可以输入第三方软件包允许用户作条码特征矩阵例如过滤异常点、运行降维、规范基因表达。filtered_feature_bc_matrix.h5信息与HDF5格式相同。filtered_feature_bc_matrix/raw_feature_bc_matrices/包含所有检测到的MEX格式条码。矩阵中的每个元素分别是与特征行和条码列相关的UMI数量。raw_feature_bc_matrix.h5信息与HDF5格式相同。raw_feature_bc_matrices/raw_probe_bc_matrix.h5包含所有检测到的条码的每个探头的UMI计数格式为HDF5格式。仅在运行探针检测管道时生产。molecule_info.h5包含所有含有有效条形码、有效UMI且高度置信度地分配给基因或蛋白质条码的分子的每分子信息。该文件对于包括 、 和 在内的其他分析管道是必需的。spacerangeraggrtargeted-comparetargeted-depth但是一般分析完成之后我们所需的下游分析所需文件主要集中于outs文件outs ├── aggregation.csv ├── aggr_tissue_positions.csv ├── analysis │ ├── clustering │ ├── diffexp │ ├── pca │ ├── tsne │ └── umap ├── cloupe.cloupe ├── filtered_feature_bc_matrix │ ├── barcodes.tsv.gz │ ├── features.tsv.gz │ └── matrix.mtx.gz ├── filtered_feature_bc_matrix.h5 ├── spatial │ ├── LV123 │ │ ├── scalefactors_json.json │ │ ├── tissue_hires_image.png │ │ └── tissue_lowres_image.png │ ├── LB456 │ │ ├── scalefactors_json.json │ │ ├── tissue_hires_image.png │ │ └── tissue_lowres_image.png │ └── LP789 │ ├── scalefactors_json.json │ ├── tissue_hires_image.png │ └── tissue_lowres_image.png ├── summary.json └── web_summary.html